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關鍵詞

乳制品、、固相萃取、磁性固相萃取、液相色譜質譜、LC-MS、SPE、mSPE

前言

誕生于上世紀中期。是種通過化學合成方法大量生產(chǎn)的抗生素。由于其廣譜性，且成本低廉易于生產(chǎn)而被廣泛應用，特別是醫(yī)療體系較為落后的第三世界國家。不幸的是，也被發(fā)現(xiàn)有明顯的不良反應，主要表現(xiàn)為對骨髓造血機能的抑制而引起的貧血和白血病等。因此，目前臨床上對其使用有著嚴格的限制。與此同時，由于其通過食物鏈累積和傳遞的影響，也在畜牧和水產(chǎn)飼養(yǎng)中被禁用。

目前，動物源性食品中的提取和凈化過程較為復雜。例如《食品安全國家標準 牛奶中殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》（GB 29688-2013）中規(guī)定，牛奶中殘留應以乙酸乙酯提取，并經(jīng)正己烷脫脂和C18柱SPE凈化。其過程繁瑣且有毒有害試劑用量較大。

本文所述方法，僅通過簡單的蛋白質沉淀和磁性固相萃取凈化，且無需氮吹濃縮即可實現(xiàn)檢測。磁性固相萃取（mSPE）是將傳統(tǒng)固相萃取材料磁化，形成磁性分散萃取劑，結合全自動提取設備，無需全程人工操作，實現(xiàn)了一鍵運行、無人值守。相對于經(jīng)典的固相萃?。⊿PE），該方法自動化程度高、簡單高效、成本低廉，適合廣泛推廣。

AUTO M32是代自動化磁性萃取系統(tǒng)，結構簡單、運行高效，結合方法學優(yōu)化，上樣體積可達3mL。適用于臨床小分子疾病標志物、食品安全和法醫(yī)毒物檢測。

MagicFlux 1000是一種基于mSPE技術的全新全自動磁性固相萃取系統(tǒng)，可于30分鐘內全自動處理最多二十個樣品，每個樣品的上樣體積可達10mL。適用于食品安全、法醫(yī)、環(huán)境污染物檢測等多個領域中的樣品凈化。該系統(tǒng)使用10寸平板電腦，基于Windows10 操作系統(tǒng)和專用的軟件，從移液、提取、輸出樣品自動化操作。

實驗過程

標準曲線配置

以30%甲醇水配制濃度為0.4、1、2、5、10、20ng/mL標準溶液，相當于原始樣品中殘留量0.08、0.2、0.4、1、2、4μg/Kg。

樣品處理

• 取以乙醇活化的4mg磁性HLB萃取劑，置于萃取管內。
• 稱取2.0g牛奶，置于15mLPP試管中，先后加入1mL10%溶液、1mL20%乙酸鋅溶液、0.4mL甲醇，漩渦混勻，以8000rpm離心5min。
• 磁性固相萃取：方法一，移取1000μL上清液為上樣溶液，放置于專用96孔板的第2~4列或第8~10列孔內，如下圖移取適當溶劑置于其余孔位內，并設置AUTO M32全自動提取儀，進行mSPE操作。

方法二，將上一步完成離心后的15mLPP試管直接放入MagicFlux 1000全自動磁性固相萃取系統(tǒng)的上樣位。參考上表在各溶劑位放入對應的溶劑，并設定運行程序。執(zhí)行mSPE操作。

• 取上述洗脫液注入LC-MS/MS分析。

注：測試樣品，準確稱取2.00g牛奶，加入2.0μL的200ng/mL標準溶液，相當于0.2μg/Kg，加入20 mL D₅-CAP（200ng/mL）同位素標記標準溶液。如上所述進行提取和分析。

實驗數(shù)據(jù)

如下圖所示，本方法定量下限為0.4ng/mL（相當于牛奶中0.08μg/Kg）?？梢钥吹礁?/span>MRM通道的色譜峰信號穩(wěn)定清晰。

下圖為測試樣品（0.2μg/Kg）色譜圖。該樣品的含量相當于《食品安全國家標準 牛奶中殘留的測定 液相色譜-串聯(lián)質譜法》（GB 29688-2013）所規(guī)定的定量下限。可以認為LC-MS結合磁性固相萃取法的整體靈敏度比上述標準方法提高了約2.5倍。

如下表所示，牛奶中添加0.2μg/Kg樣品，準確度（添加回收率）為90.9~116%，相對標準偏差為10.1%。

如下表，標準曲線各點的準確度為97.6~104.5，精密度為0.8~7.3%。

下圖為定量MRM通道的色譜峰標準曲線。

結果與討論

綜上數(shù)據(jù)可以看出，使用HLB磁性萃取劑，結合AUTO M32全自動萃取儀或MagicFlux 1000全自動磁性固相萃取儀，提取和凈化牛奶中的。經(jīng)LC-MS/MS分析測試，線性良好，結果準確精密，符合基本定量測試的方法學要求。同時，磁性固相萃取技術（mSPE）結合全自動提取系統(tǒng)AUTO M32或MagicFlux 1000，大幅度減少傳統(tǒng)SPE的移液操作和人為實時監(jiān)測，節(jié)約了人力成本，并顯著降低人為因素在前處理中的影響。

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