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　　從引物的設(shè)計(jì)原則、引物二極結(jié)構(gòu)、發(fā)夾結(jié)構(gòu)、引物內(nèi)部穩(wěn)定性等方面概括PCR引物設(shè)計(jì)的主要要點(diǎn).

　　引物（primers)：引物是人工合成的兩段寡核苷酸序列,一個(gè)引物與感興趣區(qū)域一端的一條DNA模板鏈互補(bǔ),另一個(gè)引物與感興趣區(qū)域另一端的另一條DNA模板鏈互補(bǔ).

　　引物的重要性：

　　在整個(gè)PCR體系中, 引物占有十分重要的地位.PCR的特異性要求引物與靶DNA特異結(jié)合,不與其他非目的DNA結(jié)合,PCR的靈敏性要求DNA聚合酶能對(duì)引物進(jìn)行有效的延伸,可見(jiàn)引物設(shè)計(jì)好壞與PCR結(jié)果密切相關(guān).

　　引物設(shè)計(jì)原則：

　　1、引物長(zhǎng)度

　　一般為15-30個(gè)核苷酸,在做長(zhǎng)片段PCR或做某些特殊的PCR時(shí)應(yīng)使用較長(zhǎng)的引物,但最多不超過(guò)50個(gè)核苷酸.

　　2、堿基分布的均衡性

　　同一堿基連續(xù)出現(xiàn)不應(yīng)超過(guò)5個(gè)；

　　GC含量一般40-60%;

　　GC含量太低導(dǎo)致引物Tm值較低,使用較低的退火溫度不利于提高PCR的特異性;

　　GC含量太高也易于引發(fā)非特異擴(kuò)增.

　　3、引物Tm值

　　一般要求：55℃-65℃.

　　計(jì)算：

　　對(duì)于低于20個(gè)堿基的引物,Tm值可根據(jù)Tm=4(G C) 2(A T)來(lái)粗略估算；

　　對(duì)于較長(zhǎng)引物,Tm值則需要考慮熱動(dòng)力學(xué)參數(shù),從“最近鄰位”的計(jì)算方式得到,這也是現(xiàn)有的引物設(shè)計(jì)軟件的計(jì)算方式.

　　Tm = △H/(△ S R * ln (C/4)) 16.6 log ([K ]/(1 0.7 [K ])) - 273.15　　

　　引物二級(jí)結(jié)構(gòu)：

　　引物二聚體,盡可能避免兩個(gè)引物分子之間3’端有有較多堿基互補(bǔ)

　　發(fā)夾結(jié)構(gòu)：

　　尤其是要避免引物3’端形成發(fā)夾結(jié)構(gòu),否則將嚴(yán)重影響DNA聚合酶的延伸.

　　引物3’端：

　　引物的延伸從3’端開(kāi)始,因此3’端的幾個(gè)堿基與模板DNA均需嚴(yán)格配對(duì),不能進(jìn)行任何修飾,否則不能進(jìn)行有效的延伸,甚至導(dǎo)致PCR擴(kuò)增失敗.考慮到密碼子的簡(jiǎn)并性,引物3’端個(gè)堿基不與密碼子第三個(gè)堿基配對(duì).

　　引物5’端：

　　引物5’端可以有與模板DNA不配對(duì)堿基,在5’端引入一段非模板依賴性序列.

　　5’端加上限制性核酸內(nèi)切酶位點(diǎn)序列（酶切位點(diǎn)5’端加上適當(dāng)數(shù)量的保護(hù)堿基）.

　　5’端的某一位點(diǎn)修改某個(gè)堿基,人為地在產(chǎn)物中引入該位點(diǎn)的點(diǎn)突變以作研究.

　　5’端標(biāo)記放射性元素或非放射性物質(zhì)（如、等）.

　　引物的內(nèi)部穩(wěn)定性：

　　過(guò)去認(rèn)為,引物3’端應(yīng)牢牢結(jié)合在模板上才能有效地進(jìn)行延伸,故3’端為G或C.

　　現(xiàn)在的觀點(diǎn)認(rèn)為,引物的5’端應(yīng)是相對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu),而3’端在堿基配對(duì)的情況下為低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu),即3’端盡可能選用A或T,少用G或C.

　　僅僅3’端幾個(gè)堿基與非特異位點(diǎn)上的堿基形成的低穩(wěn)定性結(jié)構(gòu)是難以有效引發(fā)引物延伸的.

　　如果3’端為富含G、C的結(jié)構(gòu),只需3’端幾個(gè)堿基與模板互補(bǔ)結(jié)合,就可能引發(fā)延伸,造成假引發(fā).

　　引物的保守性與特異性:

　　保守性：通用引物——檢測(cè)同一類病原微生物盡可能多的型別；

　　特異性：避免非特異性擴(kuò)增.

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