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　　放置過久檢測不出條帶:

　　PCR產(chǎn)物的電泳檢測時間一般為48h以內(nèi),有些于當(dāng)日電泳檢測,大于48h后帶型不規(guī)則甚致消失.：

　　假陰性,不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶：

　　PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,②引物的質(zhì)量與特異性,③酶的質(zhì)量及活性 ④PCR循環(huán)條件.尋找原因亦應(yīng)針對上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究.

　　模板：

　?、?模板中含有雜蛋白質(zhì)

　?、?模板中含有taq酶抑制劑

　　③ 模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,特別是染色體中的組蛋白

　?、?在提取制備模板時丟失過多,或吸入酚

　?、?模板核酸變性不.在酶和引物質(zhì)量好時,不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,極有可能是標(biāo)本的消化處理,模板核酸提取過程出了毛病,因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改.

　　酶失活：

　　需更換新酶,或新舊兩種酶同時使用,以分析是否因酶的活性喪失或不夠而導(dǎo)致假陰性.需注意的是有時忘加taq酶或溴乙錠.

　　引物：

　　引物質(zhì)量、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對稱,是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想、容易彌散的常見原因.有些批號的引物合成質(zhì)量有問題,兩條引物一條濃度高,一條濃度低,造成低效率的不對稱擴(kuò)增,對策為：①選定一個好的引物合成單位.②引物的濃度不僅要看od值,更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,一定要有引物條帶出現(xiàn),而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致,如一條引物有條帶,一條引物無條帶,此時做PCR有可能失敗,應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決.如一條引物亮度高,一條亮度低,在稀釋引物時要平衡其濃度.③引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效.④引物設(shè)計(jì)不合理,如引物長度不 夠,引物之間形成二聚體等.

　　mg2 濃度：

　　mg2 離子濃度對PCR擴(kuò)增效率影響很大,濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶.

　　反應(yīng)體積的改變：

　　通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20ul、30ul、50ul.或100ul,應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設(shè)定,在做小體積如20ul后,再做大體積時,一定要模索條件,否則容易失敗.

　　物理原因：

　　變性對PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要,如變性溫度低,變性時間短,極有可能出現(xiàn)假陰性;退火溫度過低,可致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率退火溫度過高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率.有時還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),檢測一下擴(kuò)增儀或水溶鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,這也是PCR失敗的原因之一.

　　靶序列變異：

　　如靶序列發(fā)生突變或缺失,影響引物與模板特異性結(jié)合,或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,其PCR擴(kuò)增是不會成功的.

　　假陽性：

　　出現(xiàn)的PCR擴(kuò)增條帶與目的靶序列條帶一致,有時其條帶更整齊,亮度更高.

　　引物設(shè)計(jì)不合適：

　　選擇的擴(kuò)增序列與非目的擴(kuò)增序列有同源性,因而在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時,擴(kuò)增出的PCR產(chǎn)物為非目的性的序列.靶序列太短或引物太短,容易出現(xiàn)假陽性.需重新設(shè)計(jì)引物.

　　靶序列或擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染：

　　這種污染有兩種原因：一是整個基因組或大片段的交叉污染,導(dǎo)致假陽性.這種假陽性可用以下方法解決：①操作時應(yīng)小心輕柔,防止將靶序列吸入加樣槍內(nèi)或?yàn)R出離心管外.②除酶及不能耐高溫的物質(zhì)外,所有試劑或 器材均應(yīng)高壓消毒.所用離心管及樣進(jìn)槍頭等均應(yīng)一次性使用.③必要時,在加標(biāo)本前,反應(yīng)管和試劑用紫外線照射,以破壞存在的核酸.二是空氣中的小片段核酸污染,這些小片段比靶序列短,但有一定的同源性.可互相拼接,與引物互補(bǔ)后,可擴(kuò)增出PCR產(chǎn)物,而導(dǎo)致假陽性的產(chǎn)生,可用巢式PCR方法來減輕或消除.

　　出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增帶：

　　PCR擴(kuò)增后出現(xiàn)的條帶與預(yù)計(jì)的大小不一致,或大或小,或者同時出現(xiàn)特異性擴(kuò)增帶與非特異性擴(kuò)增帶.非特異性條帶的出現(xiàn),其原因：一是引物與靶序列不互補(bǔ)、或引物聚合形成二聚體.二是mg2 離子濃度過高、退火溫度過低,及PCR循環(huán)次數(shù)過多有關(guān).其次是酶的質(zhì)和量,往往一些來源的酶易出現(xiàn)非特異條帶而另一來源的酶則不出現(xiàn),酶量過多有時也會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增.其對策有：①必要時重新設(shè)計(jì)引物.②減低酶量或調(diào)換另一來源的酶.③降低引物量,適當(dāng)增加模板量,減少循環(huán)次數(shù).④適當(dāng)提高退火溫度或采用二溫度點(diǎn)法(93℃變性,65℃左右退火與延伸).

　　出現(xiàn)片狀拖帶或涂抹帶：

　　PCR擴(kuò)增有時出現(xiàn)涂抹帶或片狀帶或地毯樣帶.其原因往往由于酶量過多或酶的質(zhì)量差,dntp濃度過高,mg2 濃度過高,退火溫度過低,循環(huán)次數(shù)過多引起.其對策有：①減少酶量,或調(diào)換另一來源的酶.②減少dntp的濃度.③適當(dāng)降低mg2 濃度.④增加模板量,減少循環(huán)次數(shù).　

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