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ES 細(xì)胞培養(yǎng)

原代胚胎成纖維細(xì)胞（ME）的制備

1. 取12.5-13.5dpc孕鼠，斷頸處死；

2. 將鼠腹面向上放置，70% 酒精潤(rùn)濕、消毒腹部（防止腹毛飛揚(yáng)，污染內(nèi)臟及子宮），剪開皮膚層、肌肉層，打開腹腔，將連接在子宮上的結(jié)締組織及脂肪剪去，將子宮取出，轉(zhuǎn)入無菌10cm平皿中；

3. 把平皿轉(zhuǎn)入超凈臺(tái)；

4. 用鑷子打開子宮壁，擠出鼠胚，并與胚外組織、胎盤等分離，除去鼠胚的頭、四肢及各種內(nèi)臟（主要為肝臟、肺臟、心臟和腸胃等）；

5. 將鼠胚移入另一新的無菌皿，用PBS洗三次；

6. 棄去PBS，用彎頭剪將鼠胚剪碎，加入PBS洗至溶液基本無色（1－4次）；

7. 加入適量Trypsin-EDTA（0.25% Gibco 25520，下同），體積約等于組織塊體積；

8. 用滴管輕輕吹勻，室溫下消化1－10分鐘（或消化至溶液渾濁變粘），加入與消化液等體積培養(yǎng)基，輕輕吹打混勻（5－10次），靜置；

9. 沉降后將上部溶液輕輕吸出，轉(zhuǎn)入離心管中。

10. 將細(xì)胞懸液管離心（1000轉(zhuǎn)5分鐘）；

11. 棄去上清，向沉淀中加入適量培養(yǎng)基，輕輕吹打重懸，將其分種至10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿，補(bǔ)加適量培養(yǎng)基，作標(biāo)簽（ME－0；注意：若凍存，則可以使用復(fù)蘇后的0代ME制作Feeder；若直接使用則不用0代ME細(xì)胞做Feeder，要傳到一代以后再用來制作Feeder比較好），轉(zhuǎn)入培養(yǎng)箱培養(yǎng)；

12. 視細(xì)胞生長(zhǎng)情況換液（一般3天換液一次），若細(xì)胞已長(zhǎng)滿，則凍存，或者1：3-5傳代（視細(xì)胞疏密而定），放入培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)（此后不用再換液）；1－5代的ME細(xì)胞均可用來制作Feeder。

飼養(yǎng)層細(xì)胞（Feeder）的制備

注：含10 ug/mlC的DMEM血清培養(yǎng)基（FBS占10%）（實(shí)驗(yàn)室所用MMC為10 mg/mL，Calbiochem）

1.棄去細(xì)胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，加入適量含10ug/mlC的培養(yǎng)基（DMEM+10% FBS）；

2. 放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)3小時(shí)（2－4小時(shí)）；

3. 用0.1% 明膠處理培養(yǎng)皿（將明膠加入，搖動(dòng)使明膠覆蓋全部皿底，然后吸出明膠棄去即可），室溫放置2小時(shí)以上，至皿底明膠干燥為止；

4. 棄去含有C的培養(yǎng)基，加入2－3 mL PBS，輕輕搖動(dòng)，棄去PBS，如此洗3-5次（必須洗3次以上，以便洗去殘存的，是有絲分裂抑制劑，因而對(duì)ES細(xì)胞有毒性）；

5. 加入適量消化30秒，吸去消化液，靜置至細(xì)胞層出現(xiàn)裂縫或明顯滑壁為止，加入培養(yǎng)基，吹打，種至明膠處理過的培養(yǎng)皿中即可（如細(xì)胞過稀，可再補(bǔ)加處理過的細(xì)胞），半小時(shí)后即可使用（如果急用，則可以用ES細(xì)胞培養(yǎng)基終止消化，然后與ES細(xì)胞一起轉(zhuǎn)入明膠處理過的新板上），可使用6－10天，用前更換培養(yǎng)液（如未用明膠處理培養(yǎng)皿，則需在培養(yǎng)箱中放置2小時(shí)以上方可使用；是前一天下午制作Feeder，第二天上午使用，這時(shí)的Feeder狀態(tài)，ES細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，而且萬一制作的Feeder在第二天早上發(fā)現(xiàn)出了問題，還可以趕緊補(bǔ)做）。

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