在之前的文章中（領往昔風云，看今日OpenSPR、Biacore和Fortebio孰強孰弱），我們通過實驗對比了市面上主流的無標記分子間相互作用檢測技術。今天我們來聊聊基于熒光標記的分子間相互作用檢測技術。
同無標記技術相比，利用熒光技術檢測分子間相互作用的實驗成本較低，例如熒光共振能量轉移和凝膠遷移實驗，無需昂貴的儀器便可完成結合分析。然而，基于熒光標記的檢測技術也存在自己的局限性，像凝膠遷移實驗就只能用來檢測蛋白和核酸間的相互作用。那么在具體的實驗中，研究人員該如何選擇合適的檢測技術呢？不要著急，下面我們便為大家介紹見的熒光結合分析技術，為您提供一些思路。
熒光偏振（FP）
熒光偏振技術利用偏振光激發(fā)探針上的熒光基團，根據探針遷移狀態(tài)的不同，發(fā)射光為偏振光或非偏振光。例如生物大分子旋轉相對較慢，由偏振光激發(fā)后會產生偏振信號。而小分子由于旋轉較快會導致信號去極化。通過分析發(fā)射光的偏振信號強度便可快速定量分析分子間的相互作用及酶活性檢測。
熒光偏振技術非常適用于高通量篩選實驗，但是不能得到結合動力學參數（結合/解離速率常數），且熒光基團可能會對分子間的結合產生影響，需要用其他技術手段加以驗證。中南大學湘雅醫(yī)學院發(fā)表的文章Luteolin inhibits Musashi1 binding to RNA and disrupts cancer phenotypes in glioblastoma cells就是利用該技術高通量篩選靶向癌癥相關蛋白的小分子抑制劑，之后使用我們的LSPR技術進行驗證。
熒光共振能量轉移（FRET）
熒光共振能量轉移是指在兩個不同的熒光基團中，如果一個熒光基團（供體 Donor）的發(fā)射光譜與另一個基團（受體Acceptor）的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時（一般小于100?），就可觀察到熒光能量由供體向受體轉移的現象。這樣我們就可以檢測分別帶有供體和受體基團的融合蛋白間的相互作用。同其他技術相比，FRET的優(yōu)勢是可用于研究活細胞生理條件下的蛋白間相互作用。但可檢測的樣品種類較少，目前僅適用于蛋白、核酸的檢測。同樣，由于熒光基團的介入，可能會對分子間的相互作用產生影響。
凝膠遷移實驗（EMSA）
凝膠遷移實驗又稱凝膠阻滯實驗或電泳遷移率實驗（EMSA，electrophoretic mobility shift assay），是一種用于蛋白與核酸相互作用檢測的技術。最初是用于轉錄因子與啟動子相互作用的驗證性實驗，也可應用與蛋白-DNA、蛋白-RNA互作研究。EMSA主要基于蛋白-探針復合物在凝膠電泳過程中遷移較慢的原理。根據實驗設計特異性和非特異性探針，當核酸探針與樣本蛋白混合孵育時，樣本中可以與核酸探針結合的蛋白質與探針形成蛋白-探針復合物；這種復合物由于分子量大，在進行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳時遷移較慢，而沒有結合蛋白的探針則較快；孵育的樣本在進行聚丙烯酰胺凝膠電泳并轉膜后，若蛋白-探針復合物在膜靠前的位置形成一條帶，則說明蛋白與目標探針之間有相互作用。
EMSA技術門檻、實驗成本都比較低，但僅適用于蛋白和核酸的互作檢測，實驗流程相對繁瑣。在Novel dual regulators of Pseudomonas aeruginosa essential for productive biofilms and virulence這篇文章中，研究人員首先使用EMSA檢測蛋白與核酸間的相互作用，在發(fā)現蛋白與核酸間的相互作用需要輔助調節(jié)因子參與后，使用我們的LSPR技術進行了快速的驗證。
微量熱泳動（MST）
微量熱泳動技術使用紅外激光進行加熱產生一個微觀的溫度梯度場，導致分子定向移動，再通過共價結合的熒光染料或自發(fā)熒光來監(jiān)測觀測區(qū)域的熒光信號的變化從而計算兩個相互作用分子間的KD等常數。MST技術不需要表面固定，可以在溶液中檢測任何生物分子、化合物、納米材料等分子間的相互作用，應用范圍較廣。但無法提供結合動力學參數（結合/解離速率常數）,且共價結合的染料可能會對分子間的相互作用產生影響。
綜上所述，同無標記分子間相互作用檢測技術相比，基于熒光標記的分子間相互作用檢測技術有以下共同點：
無法提供結合動力學參數（結合/解離速率常數）
熒光基團可能會對分子間的結合產生影響
通常需要使用其他技術驗證
表面等離子共振技術（SPR）作為分子間相互作用檢測金標準，無需對生物分子進行標記，檢測數據更加精確。除了兩個分子間親和力大小外，還能提供結合動力學參數（結合/解離速率常數），幫助研究人員更加深入的理解生物結合過程、藥物作用機制。加拿大Nicoya公司的OpenSPR極大的減低了傳統(tǒng)SPR儀器的操作難度，同時采用簡單穩(wěn)定的光學系統(tǒng)及大孔徑流路，讓使用者遠離高昂的維護費用。
Nicoya OpenSPR分子相互作用儀在研究中的優(yōu)勢
多參數檢測---Ka、Kd、KD、EC50、蛋白濃度測定
創(chuàng)新LSPR技術--- 檢測不受溫度、緩沖液折射率影響
易操作---1-2小時快速掌握
寬范圍檢測---pM-mM
低成本--- 實時無標記、芯片可再生
